Alteraciones en la Epigenómica de la Salmonelosis

Para poder determinar las alteraciones en la epigenómica de la Salmonelosis debemos primero definir el concepto de epigenómica.

Epigenética es la ciencia que estudia el conjunto de procesos químicos que modifican la actividad del DNA pero sin alterar su secuencia. Hoy en día está claro que hay una interacción dinámica entre los genes y el ambiente, un interfaz a escala mecanística claramente delineado y bioquímicamente impulsado. 

El genoma humano es la colección completa de ADN. El epigenoma está formado por compuestos químicos y proteínas (etiquetas químicas), que pueden unirse al ADN y dirigir acciones como la activación o desactivación de genes y el control de la producción de proteínas en células específicas. Cuando los compuestos epigenómicos se unen al ADN, modifican su función, no cambian la secuencia del ADN, se altera la forma en que las células usan las instrucciones del ADN  es decir la expresión del genoma. En concreto, la epigenómica comprende los cambios heredables en la expresión génica que no van acompañados de cambios en la secuencia de DNA. Los distintos tipos de cáncer son causados por cambios en el genoma, el epigenoma, o ambos. Los cambios en el epigenoma pueden activar o desactivar los genes que participan en la proliferación celular o la respuesta inmunitaria. Estos cambios pueden generar una proliferación descontrolada (cáncer), o la falta de capacidad del sistema inmunitario para destruir tumores.

La epigenética estudia y da explicación a estas interacciones entre el genoma y el ambiente. El ser humano o cualquier otro ser vivo nace, crece, se reproduce y muere, todo ello en constante interacción con el ambiente en el que vive. La interacción de nuestro DNA (genoma) con el ambiente que nos rodea está definido por la distinta regulación de ese DNA (epigenoma). La epigenética explica, por ejemplo, por qué una célula somática sanguínea (ej. linfocito) al ponerla en un medio ácido se convierte en una célula madre pluripotente, por qué se producen o activan ciertos tipos de cánceres o por qué desarrollamos deterioro cognitivo asociado al envejecimiento.

Alteraciones en la epigenética de la Salmonelosis

Estudios de la Universidad del Estado de Arizona (EE.UU), publicados recientemente en mBio, demuestran que las Bacterias Salmonella del serotipo Typhimurium  modificadas genéticamente pueden constituir un vehículo para trasladar compuestos terapéuticos hacia el tejido tumoral, sin dañar al hospedador; razón por la cual su utilización en el desarrollo de tratamientos contra el cáncer supone una idea muy atractiva que está siendo explorada en la actualidad.

La patogenicidad de la Salmonella se debe a la presencia de una capa de lipopolisacáridos (LPS) alrededor de la célula. Esta razón hizo que los investigadores evalúen la seguridad y la capacidad terapéutica contra el cáncer, de cepas de Salmonella mutantes para la estructura de LPS. Entonces los investigadores vieron que la relación variantes – nivel de patogenicidad (en este caso aceptable) tenían muy poco potencial terapéutico.

Posteriormente, el equipo para solucionar el problema y mejorar la cepas bacterianas, añadieron otra modificación genética a las bacterias, que permitía atenuar los genes implicados en la biosíntesis de LPS de forma condicional.  De este modo, las bacterias de Salmonella de diseño pudieron ser introducidas en ratón en una forma que no afectaría a las células normales y que permitiría colonizar los tumores y acceder al interior de las células cancerosas. Una vez allí, se volverían tóxicas. Esta transición desde una Salmonella benigna e invasiva, que no daña a las células normales hacia una tipo tóxico ocurre muy rápidamente en el tumor, debido al rapidísimo crecimiento y división celular que ocurre cuando Salmonella accede a un tumor. Aunque los investigadores indican que para optimizar las bacterias diseñadas todavía podría ser necesario introducir algunas mutaciones para atenuar su metabolismo, y los resultados deberán ser evaluados extensamente en diversos sistemas tumorales, la utilización de bacterias modificadas podría suponer un gran avance para la inmunoterapia contra el cáncer. 

Bibliografía

1. SEBBM Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular. Epigenética en neurociencias. (sede web). España: Carlos Spuch y Roberto C. (acceso 29 de mayo de 2016). Disponible en: http://www.sebbm.com/revista/articulo.asp?id=10081&catgrupo=269&tipocom=24

2. Genética Médica News. Bacterias Salmonella modificadas para eliminar las células del cáncer. (sede web). España: 2015. (acceso 29 de mayo del 2016). Disponoble en: http://revistageneticamedica.com/2015/04/25/salmonella-cancer/

3. AGROGESTIIC NEWS. Modificación epigenética: posible enfoque para reducir la infección por Salmonella enterica serovar Enteriditis asociada al estrés. (sede web). 2012. (acceso 29 de mayo de  2016). Disponible en: http://news.agrogestiic.es/articulos/modificacion-epigenetica-reducir-infeccion-salmonella-enterica/

Alteraciones en la Traducción de la Salmonelosis

Salmonella dirige su arribo a células hospederas que no son normalmente fagocíticas como la superficie de la capa mucosa de células epiteliales. Salmonella invade las células del hospedero por un mecanismo conocido como disparo (trigger). La bacteria envía señales a las células epiteliales que inducen rearreglos del citoesqueleto dando lugar a la formación de ondulamiento (ruffling) en su superficie, como respuesta al contacto. 

Se reconocen varias proteínas efectoras de la SPI-1, involucradas en los rearreglos del citoesqueleto: SipA, SopE, SopE2 y SopB.

• SipA es una proteína de unión a actina, que inhibe la despolimerización de F-actina y activa T-plasmina, su chaperona es SicA (SipE en S. enterica serovar Typhi). 
• SopE se comporta como GEF (guanine exchange factor) en las proteínas RhoGTPasas: CDC42 y Rac induciendo ruffling de la membrana, que permite la internación de Salmonella además estimula MAP cinasas (Mitogen-activated protein), Erk (quinasa reguladora por señales extracelulares), JNK (quinasa terminal) y p38. 
• La proteína SopE2 muestra un 69% de homología con la secuencia de SopE, activa a CDC42, la cual actúa con la familia de proteínas del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) para activar al complejo Arp2/3, compuesto de 7 subunidades, incluyendo dos proteínas relacionadas con actina y la proteína p41-Arc. Este complejo inicia la polimerización de actina y ramifica filamentos de actina. El gen responsable de codificar dicha proteína se encuentra localizado en el centisoma 40-42. 
• SopB (Salmonella outer protein), como se conoce para S. enterica serovar Dublin, o SigD (Salmonella invasión genes) para S. enterica serovar Typhimurium, por su actividad de inositol fosfato fosfatasa, también reorganiza el citoesqueleto de actina. 

Las proteínas efectoras pueden ser consideradas como toxinas debido a que de alguna manera afectan a la célula eucariótica, sin embargo a diferencia de éstas, carecen de receptores de unión por lo que son incapaces de tener acceso directo a su sitio de acción si no es por la contribución del SSTIII. Todo parece indicar que la penetración de Salmonella a la mucosa intestinal es esencial para causar infección letal, el hecho de bloquear la penetración a la mucosa intestinal al mutar genes involucrados en invasión, permite obtener cepas atenuadas que pudieran ser utilizados como posibles inmunógenos.

La SPI-1 codifica determinantes que median: la invasión de células del hospedero no fagocíticas, apoptosis de macrófagos in vitro y activación de caminos MAP cinasas y factores de transcripción.

Actualmente se sabe que Salmonella cuenta con cinco islas de patogenicidad: SPI-1, SPI-2, SPI-3, SPI-4 y SPI-5. La SPI- 2 también codifica para un SSTIII que se activa cuando la bacteria se encuentra intracelularmente dentro de una vacuola.

El SSTIII de Salmonella presenta las siguientes características: la proteína secretada no presenta secuencia señal amino-terminal que tenga que ser liberada, varias de las proteínas efectoras requieren de chaperonas específicas para su secreción; para la activación completa del sistema, se requiere de una señal inductora, que generalmente es el contacto con la célula del hospedero, lo cual permite la translocación de las proteínas efectoras dentro del citoplasma de la célula huésped. Además de su rol en la internalización bacteriana, los efectores transportados por SST3 codificado por SPI-1, están claramente implicados en la producción de enfermedad, ya que son capaces de modular tanto positiva como negativamente, la expresión de mediadores de la respuesta inflamatoria en el intestino. 

Bibliografía:

1. Revista Latinoamericana de Microbiología. Mecanismos moleculares de patogenicidad de Salmonella sp (sede Web). México: Figueroa, I. & Verdugo, A.; 2005 (acceso 21 de mayo de 2016). Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-1_2e.pdf

2. Departamento de Bacteriología y Virología, Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Facultad de Medicina, UdelaR. Salmonella y Salmonelosis (sede Web). Betancor, L. & Yim, L.; 2012 (acceso 21 de mayo de 2016). Disponible en: http://higiene1.higiene.edu.uy/DByV/Salmonella_y_salmonelosis.pdf

Alteraciones en la Transcripción de la Salmonelosis

Los patógenos bacterianos, requieren de la expresión coordinada de muchos de sus genes para causar una infección productiva en el hospedero. Esta expresión se inicia cuando la Salmonella entra en contacto con el medio ambiente hostil que representa el tracto gastrointestinal del hospedero, donde encuentra una gran variedad de condiciones medioambientales que le sirven como señales para que inicie la transcripción de genes que codifican factores de virulencia que le ayudarán en la interacción con la célula blanco durante su patogénesis.

La baja tensión de oxígeno y la hiperosmolaridad, parecen ser las mayores señales medio ambientales que controlan la expresión de estos genes. Dos de ellos, el pgrH y el invG, necesarios para la invasión, son expresados óptimamente a un pH de 6.5 y su expresión disminuye cuando el pH baja a 5.0; rango de pH que puede ser encontrado cuando la bacteria pasa por el estómago o dentro de los endosomas o fagolisosomas del macrófago. La mayoría de los genes relacionados con la virulencia han sido descritos y caracterizados por medio del aislamiento de mutantes in vitro. Estas mutantes, han demostrado defectos de ciertas características que parecen ser importantes para la virulencia in vivo, como por ejemplo:

•  Los genes hil, inv, spa y lpf determinan la capacidad para invadir células epiteliales cultivadas.
• Los genes mgtC y pagC juegan un papel importante en la sobrevivencia dentro de células fagocíticas.
• Los genes sip, spa e inv controlan la citotoxicidad sobre los macrófagos.
• Las proteínas sop regulan la inflamación y secreción de fluidos.
• Los genes ivi, solo se expresan durante la infección in vivo.

La interacción de la Salmonella con las células del hospedero es determinada por factores que están localizados sobre la superficie de la bacteria o que son «secretados» hacia el espacio extracelular. La secreción describe el transporte activo de proteínas desde el citoplasma bacteriano a través de las membranas internas y externas hacia la superficie bacteriana o hacia el sobrenadante. Las proteínas bacterianas secretadas son diversas y exhiben una amplia variedad de funciones tales como: proteólisis, hemólisis y pueden inducir citotoxicidad, fosforilación y desfosforilación de proteínas. En bacterias gram negativas se han descrito cinco sistemas para la secreción de proteínas (tipo I, II, III, IV, V). Estos sistemas están altamente involucrados con la patogénesis de la bacteria, la cual requiere del sistema de secreción para la virulencia. La Salmonella es la única especie descrita que contiene dos sistemas de secreción tipo III, codificados por dos grupos de genes de patogenecidad: el SPI-1 y el SPI-2. Estos grupos de genes codifican unidades funcionales completas y su incorporación dentro de una cepa benigna puede convertirla en patogénica. El producto de los genes codificados por SPI-1, como por ejemplo los genes invJ, los spa, los sip y los AvrA, son requeridos para la penetración inicial de la mucosa intestinal. Los productos de los genes codificados por SPI-2, aunque no han sido claramente estudiados, se plantea que son necesarios para el desarrollo sistémico de la infección. Algunas cepas de Salmonella contienen plásmidos que codifican genes de virulencia que están altamente asociados con bacteremia y con la diseminación de la infección.  El conocimiento de los genes que conforman el genoma bacteriano, de las proteínas que codifican y de sus funciones, permitirá comprender mejor los mecanismos de patogenecidad de estos microorganismos para generar conocimiento que permita prevenir exitosamente estas infecciones.

La Salmonella puede percibir y responder a las señales medioambientales que le proporciona el hospedero; lo cual activa la expresión de genes, la secreción de proteínas y el ensamblaje de estructuras que le permiten a la bacteria interactuar, sobrevivir y producir una infección productiva en el hospedero. La regulación positiva de muchos de estos genes está directamente relacionada con la patogenecidad, probablemente porque los productos de esta activación disparan algunos eventos intracelulares que favorecen la internalización, la adaptación y la replicación; además, favorecen el desarrollo sistémico de la infección. Algunas de las proteínas codificadas por estos genes, tienen acción enzimática que le permite a la Salmonella limitar y neutralizar los mecanismos efectores de las células fagocíticas; de esta manera, resisten el ataque montado por la célula huésped.

Bibliografía:
1. Revista Latinoamericana de Microbiología. Mecanismos moleculares de patogenicidad de Salmonella sp (sede Web). México: Figueroa, I. & Verdugo, A.; 2005 (acceso 14 de mayo de 2016). Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-1_2e.pdf

2. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias (Colombian journal of animal science and veterinary medicine). Genes y plásmidos de la Salmonella spp. asociados con virulencia (sede Web). Colombia: Saldarriaga, O. & Rugeles, M.; 2001 (acceso 14 de mayo de 2016). Disponible en: http://rccp.udea.edu.co/index.php/ojs/article/view/12

Alteraciones en la Replicación de la Salmonelosis

En la replicación del ADN, una molécula original de ADN de doble cadena es convertida en dos moléculas hijas de ADN idénticas. Durante el proceso de la replicación del ADN, se pueden presentar  cambios en la secuencia de bases de los ácidos nucleicos; es decir, mutaciones espontáneas; también se pueden generar mutaciones silenciosas o neutras, en donde no se produce un efecto fenotípico. En la Salmonella este tipo de mutaciones representan entre el 60% y 80%  de alteraciones que se producen en el ADN.

Las variaciones en el genoma de la bacteria pueden reflejarse en alteraciones en la migración de alguna o más enzimas (que representan varios loci o genes), por lo que pueden obtenerse electroferotipos, o patrones de migración específicos que permiten distinguir una cepa de otra. De esta manera, se ha concluido que S. typhi es de naturaleza clonal, es decir que ha variado poco en la evolución, al menos con respecto a una serie de enzimas básicas de su metabolismo. Otras bacterias muestran más variación, incluyendo otros serotipos de Salmonella.

El análisis de plásmidos o moléculas circulares de ADN con replicación autónoma al cromosoma, que se transfieren de manera horizontal entre bacterias, y que codifican para resistencia a antibióticos o factores de virulencia, ha revelado que la gran mayoría de las cepas de S. typhi carecen de ellos. Solamente las cepas con resistencia múltiple a antibióticos las poseen, y éstas han aparecido esporádicamente aunque su presencia se ha incrementado en los últimos años.

De manera similar, se han utilizado genes no repetidos para tipificar cepas de Salmonella sp. y S. typhi, los cuales han incluido genes del flagelo (fli), de invasividad (inv), del antígeno capsular (via), del LPS (rfb), de antígenos de superficie (omp), de proteínas de estrés (groEL), o de islas de patogenicidad (SPI-1 y SPI-2). De hecho, estos estudios y la caracterización de la secuencia nucleotídica de éstos y otros genes, ha permitido determinar que las salmonellas pertenecen a un solo género, S. enterica, por su alto grado de conservación genética.

Organización del genoma

El genoma de S. typhi CT18 está constituido por un cromosoma circular de 4,809,036 pb, con un contenido de G+C de 52.09 %, más dos plásmidos: el pHCM1 de 218,160 pb, que codifica para resistencia múltiple a antibióticos, y pHCM2 de 106,516 pb, que es críptico o de función desconocida. Existen inversiones y transposiciones de grandes segmentos, posiblemente promovidos por recombinación homóloga entre genes ribosomales (rrn), y no se observan pérdidas, inserciones, o duplicaciones de regiones cromosómicas. 

En general, parece haber menor conservación del orden cromosómico en cepas de Salmonella que infectan hospedantes específicos. Por ejemplo, el orden de los fragmentos grandes obtenidos con la enzima I-CeuI, y analizados por electroforesis de campos pulsados, es de ABCDEFG en S. typhimurium LT2, E. coli K-12, y en especies deSalmonella que crecen en diferentes hospedantes. Sin embargo, en S. typhi, S. paratyphi C, S. gallinarum, y S. pullorum, las cuales son hospedante-específicas (la última también para aves), estos fragmentos están rearreglados. La SPI-1 fue el primer locus mayor de patogenicidad descrito para Salmonella. Fue encontrado en base a una propiedad fundamental, la invasividad. La idea inicial fue identificar una mutante natural de S. typhimurium que no invadiera células epiteliales en cultivo. Posteriormente, se clonó en un plásmido vector una mezcla de fragmentos del genoma de una cepa naturalmente invasiva (banco de genes), y se introdujo (complementó) a células de la mutante, identificando un fragmento que le confería la capacidad invasiva. Así se aisló un fragmento que contenía genes de invasividad, que fue denominado invCBA. Posteriormente, se realizó mutagénesis dirigida de este locus (o sitio del genoma) en la cepa silvestre invasiva, con transposones (fragmentos de ADN que se insertan en otro ADN causando su mutación), confirmando que, al hacerlo, se disminuía la capacidad invasiva.

Generalmente la mayoría de estos errores o alteraciones en el genoma, son corregidos por mecanismos de reparación del DNA, pero algunos evaden a la corrección y pueden originar cambios que afectan a ciertas propiedades como: requerimientos nutricionales, morfología o resistencia antibiótica, por ejemplo:

• La Salmonella ha desarrollado medidas complejas para invadir las células huésped después de la inserción epitelial. Tras la interacción con las células huésped, la Salmonella un sistema de secreción tipo III (T3SS) y proteínas CTRF, lo que facilita la absorción del endotelio y la invasión. Ahora, una mutación tanto en T3SS como en las proteínas CTRF, impide que la Salmonella invada las células huésped y por ende cumpla con su ciclo infeccioso. 

• Una mutación en el gen que codifica la producción de la enzima Girasa que ayuda en el proceso de la replicación, provoca resistencia antibiótica a: quinolonas (ácido nalidíxico) y fluoroquinolonas (ciprofloxacina). Esto se debe a que la pared bacteriana ha creado mecanismos de expulsión para el antibiótico al modificar sus receptores finales.

• Otras investigaciones, han demostrado que mutaciones en  grupos de genes: PhoQ/PhoP, PmrB/PmrA, SsrA/SsrB, EnvZ/OmpR y BarA/SirA; impiden la supervivencia intracelular y la regulación de la invasión bacteriana de la Salmonella.

Bibliografía:

1. Pedrique de Aulacio Magaly. Genética Molecular (sede Web). 2008 (acceso 07 de mayo de 2016). Disponible en: http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tema_7_Gen%C3%A9tica.pdf

2. Instituto de Biotecnología, UNAM. Salmonella typhi y la fiebre tifoidea: de la biología molecular a la salud pública (sede Web). Calva Edmundo. (acceso 07 de mayo de 2016). Disponible en:  http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap4/